Светлана Кабанова
Генетический редактор СRISPR - Cas
Вы любите яблоки? Я тоже. Особенно кисло-сладкие. Вы разделяете мои вкусы или предпочитаете другие?
А если яблоко будет с червоточинкой? Считается, что червивые яблоки самые вкусные и экологически чистые, поскольку черви плохой фрукт есть не станут. Отчасти оглашусь, но обращу внимание на следующее. Поедая плод, черви оставляют внутри яблока следы своей жизнедеятельности. Последние непривлекательны сами по себе, и, кроме того, они могут стать средой размножения паразитов: бактерий, вирусов, спор грибов, в том числе плесневых. А отверстие, пробуравленное червем, может служить для них входной дверью. Поэтому проблемное место в яблоке лучше убрать. Вы ищете чем? Возьмите кухонный нож и удалите червоточинку. Вырезали? Уберите еще немного прилегающих тканей и приятного аппетита!
Выражаясь биологическим языком, мы с Вами только что отредактировали плод яблони. Потому что редактирование в биологическом плане означает «вырезание» или «разрезание». С возможной последующей вставкой требуемого материала. В зависимости от задач.
Следовательно, «вырезание» или «разрезание» ДНК (генов) - это и есть нашумевшее и многообещающее редактирование ДНК? Да. Только режут ДНК не механическими инструментами, а сложными молекулами или их группами.
В доисторическую эпоху, когда Ваша покорная слуга разрезала ДНК в лаборатории, для этих целей исследователи пользовались услугами ДНК-рестриктазы. Или «ДНК - ножа». Название этого «ножа», как Вы догадались, происходит от одноименного английского слова «restriction». ДНК-рестриктаза и сейчас в ходу, но...
Впоследствии произошло то, что позволило молекулярным биологам сменить обычный «ДНК - нож» на высокоточный «генетический скальпель». Фигурально выражаясь, это соответствует переходу от писания пером к набору текстов на компьютере. Минуя эпоху шариковых ручек и печатных машинок.
Виновником случившегося стало открытие молекулярного комплекса СRISPR - Cas. С его помощью можно эффективно редактировать гены всех живых организмов, включая геном (совокупность генов) человека. Перспективы огромны: ученые рассматривают технологию CRISPR - Cas как способ избавить человечество от тяжелых заболеваний, прежде всего наследственных. Об этом мы еще поговорим, а пока предлагаю Вам познакомиться с историей открытия СRISPR - Cas.
Лето. Солнце. Отпуск. Но не у всех. Ученые работают в поте лица даже в милом курортном городке Санта-Пола в Испании. Климат там сказочно-средиземноморский, а вишенкой на торте считается изумительный парк солончаков. Флора и фауна Санта-Пола приспособились к высокому уровню соли в воде и жили себе спокойно, пока ими не заинтересовались биологи. Неутомимые трудяги вместо пляжа и пальм выбрали лабораторию, приборы, по-разному пахнущие реактивы и... архей. Археи - это одноклеточные микроорганизмы, похожие на бактерий, но не являющиеся ими. Испанскому исследователю Франциско Мохика (Francisco Mojica) стало интересно, чем отличается генетическая начинка солеустойчивых архей от таковой у их пресноводных родственников.
Взору изумленного Франциско Мохика открылся протяженный участок ДНК археи, который он назвал «трутнем», потому что тот «ничего полезного не делал». «Трутень» состоял из нескольких повторяющихся кластеров, которые не были причиной солеустойчивости [1]. Но для чего же они там находятся? Мохика знал, что похожие кластеры были ранее обнаружены японскими учеными у бактерии кишечной палочки [2], и тоже оказались побочной находкой. Время шло, функция странных кластеров оставалась невыясненной, и ученые того времени сочли их присутствие у небольших экономных организмов непозволительной роскошью и неоправданным чудачеством эволюции.
Но надо двигаться дальше! В 1995-м году Мохика опубликовал статью [3] об обнаружении нового класса ДНК - кластеров, названных сначала иначе, а потом Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR). К 2000-му году Франциско Мохика выявил кластеры CRISPR у многих архей и бактерий, включая возбудителей туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis) и чумы (Yersinia pestis).
В 2002-м исследовательская группа из Голландии установила, что CRISPR однолюб, и имеет неизменного партнера в виде однотипной группы генов [4]. Эти гены получили название Сas (акроним от CRISPR-associated).
Дело осталось за малым - понять, для чего в нашем рациональном мире существует сцепка СRISPR - Cas?
Но как? Может СRISPR - Cas стоит сравнить с другим генетическим материалом? Поискать родственников с аналогичной «фамилией»? Да, это была отличная идея Франциско Мохика. Помог ученому в решении этой задачи своего рода «генетический Google»: мировая база данных GenBank, куда ученые складируют все прочитанные последовательности ДНК. К 2003-му году эта задача упростилась тем, что GenBank не только прочно закрепился в интернете, но и значительно расширился. Франциско Мохика начал поиски и ...
Было обнаружено, что аналогичные структуры существуют в ДНК злейших врагов бактерий: вирусов бактерий или бактериофагов [5,6]. Получается, что CRISPR бактерий носит в себе ДНК вирусов, которые их убивают? Но это же абсурд! Зачем?
Все стало на свои места, когда была выяснена роль Cas [7,8]. Cas оказался не
только верным партнером, но и отличным разрезальшиком, т.е. оператором, который на молекулярном уровне выполняет команду «Режь!».
Раз так, то было логично предположить, что CRISPR может быть «инструктором», который находит места, где надо резать (читаем - редактировать). Идея оказалась верной, была блестяще подтверждена, но причем здесь «инструктор» CRISPR и его сходство с ДНК бактериофагов?
Давайте представим себе обычную клетку, в которую проник вирус. Клетка оказалась на высоте и быстро обезвредила «нахала». Возможно, разрезала его ДНК - рестриктазами и/или Cas. Теперь мы можем наблюдать в клетке не вирус, а его плавающий генетический материал в виде «вермишели». Нарезанный на кусочки и потому неопасный. Иными словами, в клетке теперь находится как ее нормальная неразрезанная ДНК, так и «вермишель» из ДНК вируса. Что клетка может сделать? Специально или случайно она может захватить какие-то части «вермишели» из ДНК вируса и сделать их своей собственностью. «Прихватизировать». В биологии это называется не воровством, а созданием иммунологической памяти. Она существует в разных формах. У нас в виде антител и некоторых других игроков (тема отдельной статьи), а в бактериальных клетках и клетках архей в виде ДНК - «фотоальбома» из нарушителей клеточных границ, т.е. CRISPR.
Что произойдет, если в бактериальную клетку повторно проникнет вирус, который уже в ней бывал, превратился в «вермишель», а затем осел в виде иммунологической памяти? Верно, «инструктор» CRISPR «узнает» похожие на него участки в ДНК вируса (это же часть самого CRISPR!), подплывет и «приклеится» к ним как липучка, а потом скомандует: «Фа...». Нет, не «Фас!», а «Режь!». Cas сделает свое дело, и обезвреживание вируса в таком случае произойдет гораздо быстрее и эффективнее, чем раньше. Потому что CRISPR мгновенно нашел противника и четко знал, где резать.
А теперь я Вам задам провокационный вопрос, который может лестницей в небо будущего. Как Вы думаете, что произойдет, если начинку CRISPR нацелить на решение других задач? Убрать «вермишель» бактериофага и поместить вместо нее ДНК.... Что Вы предложили? Отредактировать ген слепоты? А может быть попросить Cas вырезать ген старения?
Поздравляю Вас, Вы по праву можете разделить Нобелевскою премию по химии [9] совместно с Эммануэль Шарпантье (Emmanuelle Charpentier) и Дженнифер Даудна (Jennifer Doudna)! Когда эти две замечательные женщины-ученые встретились на международной конференции в Пуэрто-Рико в 2011-ом году, предназначение СRISPR - Cas уже было известно. Но это была теория, а хотелось найти ей практическое применение! Закончились доклады, исследователи из разных стран обменялись мнениями, и председатель оргкомитета торжественно закрыл научную часть встречи. Ученых ждал многообещающий фуршет. Казалось бы, можно было бы расслабиться и попробовать эту потрясающую вкуснятину, но.... Ученые работают всегда! Возле стойки со сладостями Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна осенило: а почему бы не приспособить систему СRISPR - Cas для резки любой ДНК?
Сказано - сделано. Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна объединили усилия лабораторий, в которых работали, и начался рутинный период поисков, как с помощью СRISPR - Cas разрезать ДНК любого организма в заранее определенном месте (т.е. редактировать). Детальное описание длинных лабораторных будней мы опустим, но остановимся на достаточно быстрых результатах. Уже в 2012-ом году Даудна и Шарпантье опубликовали статью в престижном журнале Science, в которой описывали технологию редактирования различных геномов с помощью СRISPR - Cas [9].
Что Вы сказали? Генная инженерия? Действительно, генная инженерия существовала несколько десятилетий до указанной выше публикации и существует поныне. Более того, технология СRISPR - Cas - это тоже генная инженерия, но гораздо более эффективная. Потому что СRISPR - Cas действует направленно и быстро, и это уже готовая «парочка». А в «классической» генной инженерии эти «парочки» приходится конструировать каждый раз в зависимости от цели, что требует больших усилий и времени, а результат не всегда может быть гарантирован.
После выхода статьи в Science в 2012-ом году ученые всего мира поняли, что совершено революционное открытие. Был представлен метод, позволяющий заменять начинку CRISPR на адресный ген любого организма и с помощью Cas разрезать (т.е. выводить из строя) этот ненужный ген. После выяснения отношений с неподходящим геном клетки организма начинают «залечивать рану», но ненужный ген при этом не восстанавливается.
В пресс-релизе Нобелевского фонда метод редактирования генома с помощью СRISPR - Cas поэтически назван «переписыванием кода жизни» [10]. И это действительно так. С помощью CRISPR - Cas можно вносить точечные мутации (изменения в ДНК), встраивать в определенные места новые гены или, наоборот, удалять их участки, а также исправлять или заменять фрагменты генов. Если представить себе нашу ДНК в виде веревки, то CRISPR - Cas будет выглядеть как «парочка» с ножницами, красками, клеем и запчастями. Двигается «парочка» вдоль веревки, и что нужно вырезает, заменяет, подкрашивает и склеивает.
В 2016-ом году китайский пациент стал первым человеком, получившим инъекцию клеток, модифицированных системой СRISPR - Cas. В его клетках крови был инактивирован ген, кодирующий необходимые для деления раковых клеток компоненты, что привело к замедлению роста агрессивной опухоли [11].
В настоящий момент, основываясь на технологии CRISPR - Cas, ученые разрабатывают методики для лечения некоторых форм рака легких, болезней мышечной дистрофии, проблем, связанных со старческой дегенерацией сетчатки, а также лейкемии. Использование СRISPR - Cas уже показало свою эффективность в терапии таких генетических заболеваний, как бета-талассемия и серповидноклеточная анемия, нейропатия Лебера, миодистрофия Дюшена, муковисцидоз, катаракта и многих других. Система CRISPR - Cas оказалась эффективной в борьбе с бактериальными и вирусными инфекциями (включая ВИЧ и гепатит), а также паразитарными заболеваниями. Рамки данной статьи не вместят всех актуальных ссылок, но если Вы откроете медицинскую базу данных Pubmed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/) и начнете поиск на английском языке по ключевым словам «название заболевания» и «СRISPR - Cas», то получите огромное количество информации.
Методы, основанные на использовании системы CRISPR - Cas, могут эффективно применяться для редактирования геномов культивируемых стволовых клеток. Например, исправлять в них вредные мутации. Таким образом можно получить необходимое количество улучшенных (отредактированных) стволовых клеток, которые будут индивидуально подходить пациенту.
CRISPR - Cas используют в сельском хозяйстве для выведения новых сортов растений и пород животных. Недавно черно-белые коровы превратились в серо-белых. Считается, что так они лучше смогут переносить жару [12]. Лаборатории по всему миру работают над созданием растений, более устойчивых к заболеваниям и содержащих больше полезных веществ и антиаллергенных компонентов.
СRISPR - Cas позволяет оптимизировать производство требуемых химических соединений в промышленности. Например, при производстве биодизеля [13].
«Парочка» СRISPR - Cas нашла также применение при воссоздании вымерших видов [14], включая экзотических птиц и мамонтов [15].
Давайте вместе пофантазируем! Если бы был изобретен не только генетический, но и психологический редактор, то с его помощью можно было бы обезвредить агрессию, вырезать негативные мысли, особенно у диктаторов и маразматиков... Скольких войн можно было бы избежать! Как Вы считаете?
Д-р Светлана Кабанова
Литература:
- Mojica et al. Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Molecular Microbiology, 1993
- Ishino et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isoenzyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology, 1987
- Mojica et al. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning. Molecular Microbiology, 1995
- Jansen et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology, 2002
- Barrangou et al. CRISPR Provides Against Viruses in Prokaryotes. Science, 2007
- Deveau et al. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. J Bacteriol, 2008
- Bolotin et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology, 2005
- Gasiunas et al. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 109, Nummer 39, 2012
- Jinek et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science, 2012
- Cyranovsky D. CRISPR gene editing tested in a person for the first time. Nature, 2016.
- Laible et al., Holstein Friesian dairy cattle edited for diluted coat color as a potential adaptation to climate change. BMC Genomics, 2021
- Diksha Garg et al. Revolutionizing biofuel generation: Unleashing the power of CRISPR-Cas mediated gene editing of extremophiles. Microbiological Research, 2023.
- Yucong Shen. CRISPR/Cas system: A powerful tool for de-extinction. Theoretical and Natural Science, 2023
- Bringing the Wooly Mammoth back to life with CRISPR/CAS9. Splice, 2017.
